PREPARACIÓN DE EXTENSIONES

FUNDAMENTO

Una extensión o frotis sanguíneo consiste en recubrir parcialmente un portaobjetos con una gota de sangre de tal manera que las células de ésta se dispongan formando una sola capa de ellas.

Es una técnica muy utilizada en hematológica que nos permite obtener una información muy valiosa, tanto del la fórmula leucocitaria como del estudio de la morfología de las células.

El anticoagulante de elección es el EDTA. La heparina no debe usarse para la tinción de

células sanguíneas porque favorece la agregación de las plaquetas. Además favorece la aparición de un refuerzo de tonalidad azul de las tinciones cuando se emplea la coloración panóptica.

MATERIAL

• Portaobjetos.
• Para su conservación antes de su empleo deben guardarse en una mezcla de metanol (3 partes) y acetona (1 parte).
• Los portas sucios deben lavarse en agua caliente (60ºC) con detergente, y a continuación, sumergirlos varias veces en un recipiente con agua caliente, finalmente secarlos.
• Otro método para limpiarlos es sumergirlos en una solución de dicromato potásico (20 g de dicromato potásico en 100 ml de agua y 900 de sulfúrico concentrado) durante 48h., lavarlos a continuación. Una vez limpios se conservan en alcohol metílico al 95%.
• Portaobjetos esmerilado.
• Sangre
• Capilares.
  

TÉCNICA

1. Se preparan dos portas de cristal limpio y desengrasado, uno de ellos normal y el otro esmerilado y biselado.
2. Homogeneizar la sangre mediante 10 inversiones como mínimo.
3. Llenamos un capilar con la sangre y dando unos golpecitos en el porta depositamos una pequeña gota (2-5 μl) de sangre sobre la línea central de éste aproximadamente a 1 o 2 cm de uno de sus extremos.
4. Con el porta esmerilado se hace contacto con la gota manteniendo una inclinación de unos 45ºC y llevándolo hacia atrás, la sangre alcanza por capilaridad todo el ancho del porta. Es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del porta sobre el que se realizará la extensión.
5. Se arrastrará con movimiento uniforme y a una velocidad media por todo el porta donde se depositó la sangre. El deslizamiento debe acabar a 1cm del extremo final con un movimiento de ascensión del porta extensor. 
• El grosor de la extensión obtenida depende de la cantidad de sangre en la gota, de la concentración de Hb y de la velocidad con que esta se ha realizado. 
• Con un ángulo superior a 45º, la extensión será gruesa y corta, con uno inferior será larga y fina. A mayor velocidad, mayor grosor. 
• Una buena extensión debe de tener entre 3 y 4 cm de longitud.
6. La extensión debe ser cada vez más delgada y terminar antes de llegar al extremo opuesto del porta.
7. Una vez hemos realizado el frotis se deja secar a temperatura ambiente y en posición horizontal (mínimo 30 minutos), para que sus células no se distorsionen. Para ello podemos agitar varias veces el porta al aire hasta comprobar por el cambio de aspecto de la preparación que esta se ha secado, si se aplica otro método se altera la morfología de los elementos mononucleados (monocitos y linfocitos).
8. Posteriormente podemos fijar la preparación bañando el frotis en metanol, esperamos unos minutos y lo lavamos con agua destilada. Esto sirve para poderlo guardar y tiene como objetivo la inmovilización de las estructuras del material en estudio evitando el rápido deterioro dejándolas en un estado lo más parecido posible al vivo. Aunque una vez secas es conveniente teñirlas lo antes posible (nunca después de 24h.) porque el plasma presente en la muestra puede interferir en el proceso de tinción y producir un fondo excesivamente azul.